含人神经营养素-3的重组腺病毒的高效制备

Efficient Generation of Recombinant Adenoviruses Expressing Human Neurotrophin-3

潘曦;孙虹;

1:中南大学湘雅三医院耳鼻咽喉-头颈外科

2:中南大学湘雅三医院耳鼻咽喉-头颈外科 长沙410013

3:长沙410013

摘要
目的采用改良的细菌内同源重组法快速高效构建含人神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)的重组腺病毒,为其用于神经性聋的在体研究做准备。方法将人全长NT-3基因亚克隆至带绿色荧光蛋白(greenflu-orescent protein,GFP)的穿梭质粒pshuttle-IRES-hrGFP-1上,用电穿孔法使线性化的重组穿梭质粒与预转入腺病毒骨架pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183-AD-1同源重组,脂质体法转染AD293细胞并大量扩增、柱层析纯化得到重组腺病毒pAdeasy-NT-3,GFP测定病毒滴度。结果PCR检测证明人NT-3已整合入腺病毒基因组并表达;Western blot证实在感染重组腺病毒pAdeasy-NT-3的Hela细胞中有相应NT-3蛋白表达;病毒滴度分别为pAdeasy-NT-3109U/ml、pAdeasy-hrGFP1010U/ml。结论利用新型的腺病毒载体Adeasy XL系统可以快速构建同时表达GFP和NT-3的重组复制缺陷型腺病毒pAdeasy-NT-3,柱层析纯化法能制备高纯度的病毒。
关键词
神经营养素-3;腺病毒;Adeasy XL系统
基金项目(Foundation):
国家自然科学基金资助项目(编号30371531);; 湖南省自然科学基金资助项目(编号02JJY2050)
作者
潘曦;孙虹;
参考文献

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