小鼠耳蜗神经营养因子-3基因的克隆及其基因工程细胞模型的建立

Clone Mouse Cochlear Neurotrophin-3 Gene and Construce the Model of its Genetic Engieering Cells

高下;王锦玲;杨安钢;许彦鸣;王枫;高辉

1:第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科

2:第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科

3:第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室

4:第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室

摘要
目的 克隆小鼠耳蜗组织神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT3)基因,并转染该基因至体外培养的T淋巴细胞系的Jurkat细胞,建立能够表达和分泌NT3的基因工程细胞模型,为后续体内应用作准备。方法 用反转录PCR方法扩增NT3基因,定向克隆入测序载体pUC19。酶切和测序鉴定正确后,再以pUC19-NT3质粒为模板,通过 PCR方法得到上下游能够与 pCDNA3载体中酶切位点匹配的NT3片段,进一步克隆获得 pCDNA3-NT3质粒。酶切鉴定正确的质粒经阳离子脂质体包埋转染入Jurkat细胞,通过G418反复筛选后,有克隆形成再扩大培养;收集部分细胞提取其中的总RNA,反转录PCR检测有无NT3基因片段存在;并利用这些细胞的培养上清鉴定有无生物学活性。结果 正确克隆的小鼠耳蜗组织NT3基因转染Jurkat细胞后,能够表达和分泌NT3蛋白并具有生物学活性,促进离体毛细胞和听觉神经元的存活。结论 在体外建立表达NT3基因并分泌NT3蛋白的基因工程细胞模型是可行的,为进一步应用到体内治疗感音神经性聋奠定了实验基础。
关键词
神经营养因子-3;耳蜗;克隆;基因治疗
基金项目(Foundation):
作者
高下;王锦玲;杨安钢;许彦鸣;王枫;高辉
参考文献

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